黄曲霉碱性蛋白酶的分离、优化及固定化研究

摘要

本研究对碱性蛋白酶产菌进行分离、鉴定及碱性蛋白酶产菌培养条件的优化。以明胶琼脂培养基进行初步筛选。其次，进行明胶液化试验，以检查碱性ph条件下功能蛋白酶的产量。与工艺开发相关的研究包括优化不同的发酵条件以提高酶的产量，其中分离的黄曲霉固态发酵生产碱性蛋白酶的培养条件(物理和营养因素)进行了研究。选择不同类型的基质培养黄曲霉。结果表明，碱性蛋白酶在温度(280C)、pH为8、孵育时间为168 h时产酶量最高，其中金属离子(Mn)、氮源(蛋白胨)和碳源(蔗糖)水解区最大。在上述条件下可获得最高的光密度和蛋白质浓度。采用海藻酸钠固定化技术固定化硫酸铵盐沉淀法对培养滤液中的碱性蛋白酶进行部分纯化。洗涤试验结果表明，该酶能完全去除血迹，对洗涤剂工业具有重要意义。

关键字

戒烟的障碍;辞职原因;香烟;饮酒;并发

简介

酶蛋白质是否催化生化反应[1］．蛋白酶分解肽键产生氨基酸和其他较小的肽[2］．根据它们在特定pH值范围内的最大活性，它们被分为酸性、中性或碱性;或特征活性位点群，如金属、天冬氨酸、半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶[3.］．虽然产生蛋白酶的微生物、植物和动物在自然界中具有世界性的分布;微生物群落是蛋白酶大规模生产的首选，因为其生长速度快，生活简单，可生成具有所需性能的新型重组酶。微生物源碱性蛋白酶因其生化多样性，在制革和食品工业、医药配方、洗涤剂以及废物处理、银回收和氨基酸混合物分解等过程中具有巨大的工业潜力[4］．微生物碱性蛋白酶在家庭中有最大的用途洗衣全球洗涤剂年产量约为130亿吨[5］．

土壤是微生物/生物活动的动态介质。通过土壤传播的真菌可在广泛的ph值范围内存活。多名工作人员提供的资料显示，真菌广泛存在于各种生境的土壤中，包括根际土壤、家禽养殖场土壤[5]、花园土壤、沙土、屠场土壤样本等。为了生产某种特定的产品，如蛋白酶，发酵的方式(固体发酵或浸没发酵)对获得最高产量至关重要[6］．酶的成本取决于它的生产策略和下游加工。在商业规模上，固态发酵更广泛地用于酶的生产，但固态发酵比固态发酵有几个优点，如需水量少，下游加工不复杂等。在尝试的不同微生物群中，丝状真菌在SSF中获得了很高的商业接受度[7］．

考虑到这一点，本研究旨在从竹林土壤中分离出碱性蛋白酶真菌，并优化各种培养条件以提高其产酶率。人们努力使产生的酶固定，使它们保持活性以备将来使用。

材料与方法

样本地点的选择

以竹林土壤为调查样地。选择了三个地点，即中央邦贾巴尔普尔区的TFRI地区，SFRI地区和GCF地区。

样品采集与处理

使用无菌土壤搅钻、手铲和塑料袋在未受干扰的地点的不同采样点采集土壤样品。用螺旋钻挖出20厘米深的土壤，然后立即用手铲铲入无菌塑料袋。样品从每个站点的5个点采集，然后混合在一起，以获得具有代表性的样品，并购买到实验室进行进一步研究。样品连续稀释至10⁵使用稀释剂。

真菌的分离

制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基和玫瑰孟加拉琼脂培养基(pH调至10)并进行高压灭菌。取1 ml连续稀释的样品，用倒板法接种于已灭菌、预凝固的PDA和RBA琼脂平板中，28℃孵育2-3天。

真菌分离株鉴定

进一步将分离株接种于无菌PDA平板上，在28℃下培养48小时，以获得纯真菌培养物。真菌分离株的菌落形态及显微镜检查(图1)用于确定生殖和营养结构。鉴定是用一本教科书进行的真菌学［8］．

碱性蛋白酶产量初步估算(水解试验明确区)

制备明胶琼脂培养基并消毒。真菌培养物采用点接种法接种于制备好的平板上，28℃保存72 h。在孵育24小时后，观察使用10% TCA溶液水解的清晰区。水解区最高的真菌分离物被用于进一步研究(图2)．

明胶液化试验

制备明胶培养基，消毒后制备刺。不同真菌分离株垂直接种，28℃孵育3 d。取出试管，冷冻30分钟，观察凝固情况。

真菌生物量测定

选择的真菌培养物接种在预先灭菌的PDA肉汤中，在28°C下孵育5天。培养后得到的真菌垫用预称重的Whatman 1号滤纸过滤，用烘箱烘干并称重。

大规模生产

所选真菌分离物采用固态发酵法大量生产，在烧瓶中取10 g碎米，用20 ml矿物盐溶液(KH₂阿宝₄-0.7 g, K₂HPO₄- 0.7克MgSO₄.7H₂O - 0.7 g, NH₄没有_3.- 1.0 g, NaCl - O.OO5 g, FeSO₄.7H₂0 - 0.002 g, ZNSO₄.7H₂0 - 0.002 g, MnSO₄.7H₂0 - 0.001 g，蒸馏水- 1000毫升)，灭菌，冷却，接种，在28°C孵育120小时。

粗酶的提取

将10 ml 0.1%的tween 80溶液加入2 g发酵底物中，在旋转摇床上以180转/分的速度均质1小时。通过在40C下8000 rpm离心15分钟去除固体，所得的清上清用于进一步研究。

优化

以pH、温度、氮源、碳源、培养时间、金属离子为产蛋白酶条件，对培养条件进行优化。

pH值

取3个锥形烧瓶，每个烧瓶中加入10克碎米和20毫升矿物盐溶液，消毒冷却。使用0.1 N HCl和0.1 N NaOH将pH调整为8,10,12。瓶在28°C的BOD培养箱中保存5天。

温度

同样的过程再次进行，除了三个烧瓶在不同的温度下孵育5天，即28°C, 40°C和60°C。

氮源

取3个锥形烧瓶，每个烧瓶中加入10g碎米和20ml矿物盐溶液，其中添加不同(0.5%)氮源，即蛋白胨，牛肉膏和硫酸铵，消毒冷却。选择真菌进行接种和培养。

碳源

3个锥形烧瓶，每个装有10g碎米和20ml矿物盐溶液，分别加入不同碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉)，消毒冷却。所有的烧瓶都接种了所选的真菌。

金属离子

以MnSO形式存在的不同金属离子₄, FeSO₄, ZnSO₄分别加入3个装有10 g碎米的Erlenmeyer烧瓶和20 ml矿物盐溶液中，28℃孵育5天。

潜伏期

研究培养时间对乳酸菌的影响蛋白酶制作3个底物和接种物相似的锥形瓶，在相同温度下孵育24小时、72小时、168小时，5天后观察。

蛋白酶产量的定量估计

按Chopra和Mathur的方法定量估计碱性蛋白酶的产量。在试管中取2 gm发酵物，加入10 ml 1% tween 80溶液。在旋转振动筛上以180转/分的转速摇1小时。在4°C下，以10,000 rpm离心20 min。将颗粒丢弃，上清液作为无细胞提取物(酶液)进行进一步研究。取2%酪蛋白1ml作为蛋白样品，加入酶液1ml。在40℃下孵育10 min，然后用2ml 10% TCA溶液停止反应，室温下保持恒定20 min, 8000 rpm离心10 min。收集上清，加入Lowery试剂I和II各0.5 ml孵育20 min，在650nm处测量光密度。

蛋白酶的部分纯化

酶纯化是工业酶生产过程中的关键步骤之一。采用硫酸铵沉淀法对碱性蛋白酶进行了部分纯化。用20%、40%和80%硫酸铵溶液饱和上清液。

固定

对真菌和蛋白酶进行了全细胞固定化和游离固定化酶分别。对于全细胞固定化，真菌席子被粉碎并溶解在2%海藻酸钠溶液(1:1)中，而对于无细胞固定化，用硫酸铵溶液处理得到的沉淀物被过滤出来并重新溶解在TrisHCl中。该溶液与海藻酸钠(2%)按1:1的比例混合。然后将这些混合物放入0.2 M氯化钙的冷冻溶液中²连续震动4°C。珠子用去离子水清洗3-4次，最后用50mM TrisHCl缓冲液清洗，并重新检查其活性(图3)．

清洗测试

取3块细棉布，每块棉布上都沾上血迹，晾干15分钟。取3块石化板，在第一块石化板中加入蒸馏水(DW)，在第二块石化板中加入蒸馏水和洗涤剂，第三块石化板中加入蒸馏水、洗涤剂和碱性蛋白酶溶液的混合物。将沾有血点的细棉布放在每个胸围上，静置15分钟。然后取出布，晾干，观察血迹的去除情况(图4)．

结果与讨论

将不同的土壤样品连续稀释至10-5稀释度，接种于马铃薯葡萄糖琼脂和玫瑰孟加拉琼脂，培养后在平板上获得30株真菌分离株，属于10个不同属，包括曲霉属真菌青霉菌,镰刀菌素，根霉，毛霉，链孢菌，弯孢菌还有三种未知的分离物。曲霉属真菌Sp.在其中占主导地位。的成员曲霉属真菌在土壤中被广泛报道，因为它们的性质允许它们有营养和水分，用于所有不同的生命周期研究。已发表的全球分布的工作曲霉属真菌在土壤中的含量已由德梅什记录[9]。本调查中发现的第二大优势属为镰刀菌素spp。

对于蛋白酶生产的初步筛选，每个真菌培养物都是点接种在Reese琼脂培养基上，然后在28°C下培养，在应用新鲜制备的10% TCA溶液时产生清晰的水解区。在测试的10个分离株中，有6个分离株可以产生碱性蛋白酶。真菌培养显示碱性蛋白酶生产黄曲霉，黑曲霉，种类镰刀菌素,根霉、链格孢属而且青霉菌．在测试的6个培养物中，前三个显示出明确的水解区，而其他的凝胶液化试验结果呈阳性。曲霉属真菌flavus给出了最高区域直径25毫米，因此它被用于进一步研究。

优化

区域直径的优化曲霉属真菌在不同的pH、温度、孵育期和不同金属、氮源、碳源的使用条件下，黄曲霉会出现或消失大小不一的条带。以带径最大为产碱性蛋白酶的最佳条件(表1)．同样，在进行Lowry的蛋白质估计试验时获得的最高OD值和蛋白质浓度被认为是由所选真菌产生碱性蛋白酶的最佳条件(表2)．

表1。水解试验清区对蛋白酶产率的定性分析。

表2。用劳瑞法定量测定蛋白酶的产生。

pH的影响

在测试的3个pH值范围(8,10,12)中，发现区域的直径分别为30mm, 8mm和没有区域。pH值8时最高直径30毫米表明它最适合这种真菌分离物。在Kalpana进行的一项研究中，碱性蛋白酶的最佳pH值为黑曲霉发现为10.0。还Derhum [10]得出了蛋白酶的最适pH芽孢杆菌sp塞尔马。S aquaticus位于10.0 - 10.5之间。结果表明，碱性范围适合真菌自身生长和蛋白酶生产。

温度效应

温度是影响酶最大活性的关键因素，是优化工业酶生产的必要条件。在28°C、40°C和60°C三个测试温度范围中，在28°C时发现区域的最大直径为10毫米，而在其他温度范围内没有看到区域。在相同温度下，最高浓度为9.47 mg/ml。乔杜里[Chowdhary]也得到了类似的结果。11]使碱性蛋白酶的产量最高黑曲霉而且镰刀菌素sp在相似的温度范围内。Nasuno和Onara进行的研究表明，在35°C使用时真菌生物量和蛋白酶产量最大黄曲霉，米曲霉而且青霉菌godliwskii这支持了目前调查的结果。

碳源效应

不同碳源以单糖和多糖的形式添加对酶的产率均有影响。在葡萄糖、蔗糖和淀粉3种碳源中，蔗糖的效果最好，条带大小为20 mm，光密度为1.993，蛋白浓度为18.48 mg/ml。以葡萄糖和淀粉为碳源时蛋白酶的产量相对较低。Malathi和Chakraborty[12]报告说蔗糖是一种有效的碳源黄曲霉而葡萄糖被观察到对Conidiobolous coronatus据Lakshman报道[13］．

潜伏期的影响

研究了不同培养时间对碱性蛋白酶产率的影响黄曲霉．时间段分别为24小时、72小时和168小时。在直径为21.6 mm的Reese琼脂板孵育24小时后，进行Lowry's试验，获得最高水解区蛋白质在培养168 h时，其最高光密度为2.378，蛋白质浓度为22.43 mg/ml。

金属离子效应

碱性蛋白酶的产生似乎随培养基中不同金属离子的使用而不同。三种金属中使用FeSO₄, MnSO₄和ZnSO₄使用MnSO时，得到的最高区域直径为8 mm，光密度为1.172，浓度为10.05 mg/ml₄．Yuan-Chi-Su进行的一项研究[14]据报道，Mn^{2 +}和Ca^{2 +}激活了酶的活性。

氮源效应

试验了不同有机氮源和无机氮源对碱性蛋白酶产率的影响。其中最佳氮源为蛋白胨，区径为19.5 mm，光密度为0.650，氮源浓度为4.69 mg/ml。Chinnaswamy还报道了蛋白胨和牛肉提取物的蛋白酶活性，这可以提高蛋白酶的产量。

固态发酵

得到碱性蛋白酶产酶黄曲霉大量生产固态发酵．固态发酵具有许多优点，包括使用昂贵的底物，简单的下游加工和较低的能量需求与浸泡发酵。为此，用碎米作为蛋白质底物，经过7天的培养，获得了足够的生长，被证明是真菌生长的良好固体底物。这一发现与夏尔马[15他们报告说固态发酵具有许多优点，包括高容量生产力，相对较高的产品浓度和对简单发酵设备的要求。发酵后的产品也可以直接用作酶的来源。

部分净化和固定化

酶纯化是工业生产中的关键步骤之一酶的生产的过程。采用硫酸铵沉淀法对碱性蛋白酶进行了部分纯化。用20%、40%、80%硫酸铵溶液饱和上清液。在Tris - HCl中适当溶解，固定化后获得最佳的酶活性。

将部分纯化的蛋白酶固定在海藻酸钠珠中。珠子的重量为2.385克。通过在酪蛋白肉汤中测试，然后用Lowry方法，发现珠子具有功能，光密度增加。无细胞固定化珠的记录光密度为1.980，而全细胞固定化珠的记录光密度为1.432。这表明，在蛋白酶生产方面，细胞游离固定化是更有益和经济的黄曲霉．

清洗测试

除了蛋白酶的一些商业应用外，洗涤剂工业的脱色应用是其最重要的潜力。本研究采用部分纯化的碱性蛋白酶对棉布上的血迹进行去除。蒸馏水几乎洗不掉任何污渍。洗涤剂溶液几乎不能去除血迹，而洗涤剂溶液与纯化碱性蛋白酶的组合则能完全去除棉布上的血迹。这表明从分离的黄曲霉中获得的蛋白酶在洗涤工业和纺织工业中具有重要的用途和意义。

结论

蛋白酶在工业上具有重要意义。本研究表明，黄曲霉是一种高效的产蛋白酶真菌。结果表明，在温度(28℃)、pH值(8)、培养时间(168 h)、金属离子(Mn)、氮源(蛋白胨)、碳源(蔗糖)水解区最大、光密度最高、蛋白浓度最大的条件下，黄曲霉碱性蛋白酶产率最高。洗涤试验可以完全去除血迹，这表明这种酶与许多其他行业一样，对洗涤剂行业非常重要。

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