米曲霉固态发酵过热豆粕(废料)生产蛋白酶

s.a. Thakur¹, S.N.Nemade²， Sharanappa A。^3.

化学工程系助理教授。，SSBT’s College of Engineering & Tech., Bambhori, Jalgaon, M.S., India
印度阿科拉市巴胡尔冈市工程技术学院化学工程系副教授
印度卡纳塔克邦胡布利市维德亚纳加尔B.V.B.工程技术学院生物技术系助理教授

摘要

农用工业废弃物的生化转化是一种有效的附加值途径。在从大豆种子中提取油的过程中，由于提供了过多的热量或在脱溶剂中保留了较长时间，由于过热而降低了粕质，从而拒绝作为动物饲料。利用米曲霉(NCIM No.649)进行固态发酵回收蛋白酶，显示了过热豆粕(废豆粕)作为蛋白酶来源的良好潜力。在研究过程中，测量了不同粒径、pH值、含水量、培养时间和蛋白酶活性的影响。

关键字

固态发酵，过热豆粕，蛋白酶

介绍

农业工业废物的利用提供了替代基质，并有助于解决污染问题，否则污染问题可能导致其处置问题固态发酵在将农业工业残留物转化为增值产品方面的潜力是巨大的。酶是取代传统手段满足工业需求的解决方案。具有成本效益，环境友好型酶有助于更可持续的工业发展[2]。农用工业基质被认为是固体发酵(SSF)产酶的最佳基质。与SSF[3]相比，沉液发酵产酶成本较高。SSF工艺具有显著降低酶生产成本的潜力，因为其能源需求更低，生产率更高，排出量更小，发酵设备更简单。农用工业残留物通常被认为是SSF过程的最佳底物，SSF产酶也不例外[4]。SSF利用农用工业废物作为支持和/或碳源，生产各种增值产品，如单细胞蛋白、工业酶、次级代谢产物和精细化学品[5]。

油籽饼富含蛋白质，被认为是很好的食物补充剂，一些已被用于家禽、鱼类和猪的饲料生产。它们还为各种生物技术过程增加价值，如通过发酵生产酶、抗生素和蘑菇。大多数豆粕是通过溶剂萃取工艺生产的，在用溶剂己烷提取油之前，大豆被裂解、加热和剥皮。一旦油被除去，薄片被烤成粉。在这个生产过程中，温度是至关重要的，以使生大豆[7]中天然存在的抗营养因子失活。但是，要保持最佳的营养价值，一定不能让豆粕经受过热过热降低其对家禽的营养价值[8,9,10]。有研究表明，豆粕的过度烹饪会降低氨基酸的消化率[11,12]。过高的温度或加热时间降低了美拉德反应中氨基酸的可用性[13]:并倾向于破坏某些氨基酸[14]，氨基酸消化率的降低和生长反应的减少似乎与美拉德反应有关，交联在较小程度上参与[12]。除了化学成分外，过度加工的豆粕的颜色差异也很明显，这表明在美拉德反应的后期[15]发生了褐变。由于黄褐色和蛋白质含量低而过热的豆粕已被拒绝，因此有效的废物管理是必不可少的。

蛋白酶是最重要的商业酶之一，广泛应用于食品加工、洗涤剂、乳品工业和皮革制造。碱性蛋白酶(或称Subtilisins, E.C. 3.4.21.14)是一组重要的生理和商业酶，在蛋白质[17]的水解中起特定的催化作用。蛋白酶可以从植物、动物或微生物来源中获得，但微生物来源因其广泛的生化多样性和生物工程潜力等多种优势而最受青睐。真菌蛋白酶在很宽的pH范围内(4-11)具有活性，并表现出广泛的底物特异性[19]。

微生物和目录

米曲霉广泛应用于亚洲食品发酵;因此，其蛋白酶可用于食品加工和其他应用[20]。米曲霉具有产生半纤维素酶、水解酶、果胶酶、脂肪酶、单宁酶等酶的能力，以大豆壳为底物显示出5种纤维素水解酶活性[21]。近年来的研究结果表明，利用米曲霉和芽孢杆菌两种微生物发酵豆壳和豆粕，可降解豆壳纤维，提高豆壳蛋白质含量，降解豆粕中的低聚糖，降解豆粕蛋白肽大小[22]。米曲霉(NCIM No.649)在pH为5.6倾斜的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上4℃保持。经托盘干燥和研磨后，通过筛分将基材制备成合适的网目尺寸。在不同的250毫升锥形瓶或石化板中分别取10克以上研磨的基质，用15毫升磷酸盐缓冲液(7.2 pH值)润湿。将湿润的底物放入高压灭菌器中，在121℃下灭菌15分钟，以使底物适当蒸煮，并增加其对微生物的适应性。米曲霉(NCIM No.649)孢子无菌转移到马铃薯葡萄糖肉汤中，在100 ml锥形瓶中装有50 ml灭菌接种培养基(在121℃下灭菌15分钟)。将烧瓶置于37℃培养箱中48小时。 The homogenous spores suspension (106 –107 spores / ml) was used as inoculums [23,24]. Autoclave was used for sterilizing glass wares and media to avoid contamination of undesired microorganism.

固态发酵

固态发酵的基质是加热过的豆粕，从印度马哈拉施特拉邦杜勒(Maharashtra, India)的Maharashtra Oil Extraction ppt . Ltd.收集。底物预表征为含油量0.8%，水分含量7.8%，蛋白质含量42%，纤维含量9.4%，灰分含量2.4%。对基材消毒后，将基材冷却至室温。在无菌移液管的帮助下，在层流中加入培养皿中10 gm和250 ml锥形瓶中15 gm的底物，接种量为30% (W/V)。

将米曲霉(NCIM No.649)接种于过热的豆粕(废料)上。接种后，在37℃下孵育2天。每隔12小时，轻轻摇动SSF介质烧瓶和石化板，使基质和微生物混合均匀。

在每个锥形瓶中加入pH为6.9的0.1 M磷酸钠缓冲液，以1:10 (W/ V)提取发酵后的过热豆粕样品。发酵后的底物首先在250ml的锥形瓶中分层空气流动，然后加入缓冲液。烧瓶以每分钟150转的速度摇晃60分钟，然后用细棉布或什么滤纸过滤。收集的滤液在室温下以1000rpm离心10分钟。精心收集上清液，作为粗酶提物测定蛋白酶活性[25]。

用改进的Anson方法测定蛋白酶活性。蛋白质用Lowry法测定。用Lowry方法测定了在福林-西卡妥试剂中，蛋白质中的氨基酸、酪氨酸和色氨酸使磷钼磷钨基成分还原而成的蓝色，以及蛋白质与碱性酒石酸铜发生双缩脲反应而成的蓝色。

结果与讨论

研究了不同粒径、pH值、含水量、培养时间和蛋白酶活性的影响。

以过热的豆粕(废)样品为底物，研究了粒径对蛋白酶活性的影响。将底物研磨后取0.075 mm ~ 0.850 mm不同粒径的底物，研究粒径对酶活性的影响。采用振动筛分离不同粒径的底物颗粒。在锥形瓶(250 ml)中取每种粒径的底物，在37℃下进行SSF 48小时。粗酶提取;每种颗粒大小的酶活性读数被记录下来。酶活性的平均读数(以百分比表示)与颗粒大小的关系图如图1所示。据观察，粒径为0.212mm的颗粒由于表面积小，具有更好的呼吸/曝气和消化效率。相比之下，较大的底物颗粒或块状物可能会干扰微生物的呼吸/通气和原料的消化不良，从而导致生长和酶的产生不良。对于蛋白酶的活性，当粒径从0.850 mm减小到0.212 mm时，酶的活性增加，而当粒径进一步减小到0.075 mm时，酶的活性降低。 Optimal activity of 1283 U/g was seen in 0.212 mm particle size.

图1:粒径对蛋白酶活性的影响

采用粒径为0.212 mm的颗粒，考察pH值、含水量、孵育时间和蛋白酶活性的影响

1.pH对酶活的影响:采用SSF方法研究孵育pH对酶活的影响。湿润的过热豆粕(废物)的初始pH值约为6.2。磷酸盐缓冲液(pH 7.2)用于在不同的发酵中调整初始pH值大于6.2。对于蛋白酶活性，pH从6增加到7.4，酶活性增加，pH进一步增加，酶活性降低。图2中pH为7.4时的最佳活性为1281 U/g。

2.水分含量对酶活性的影响:已知基质的初始水分含量严重影响霉菌生长和酶的产生。底物理化性质的影响影响酶的生产。基质中水分的存在使霉菌更容易获得营养物质。过多的水会对氧在基质中的扩散产生不利影响。在这项工作中，在接种孢子前，分别在不同的实验中将基质的初始含水量调整为30,35,40,45,50和55%。结果表明，最佳初始水分水平为45%左右，蛋白酶活性为1254 U/g。

3.培养时间对酶活性的影响:在37℃下，通过改变培养时间2 ~ 7天进行SSF。潜伏期从2天增加到4天，蛋白酶活性增加，而潜伏期从5天及以上增加，蛋白酶活性降低。96 h时活性最佳值为1345.14 U/g。

4.蛋白酶活性测定:用Lowry法测定酶蛋白浓度。用紫外分光光度计测定不同粒径下的吸光度光密度，并计算蛋白酶活性。

记录的蛋白酶活性表明，酶活性随着底物颗粒大小的增加而降低。

结论

过热的豆粕(废物)显示出蛋白酶作为一种增值产品的良好回收潜力，提供了有效的农用工业废物修复。测定了米曲霉(NCIM No.649)在豆粕(高温豆粕)上产生蛋白酶的最大活性:粒径(0.212mm为1283 U/g)、孵育pH (pH 7.4为1281 U/g)、孵育时间(第4天为1345.14 U/g)、含水量(45%为1254 U/g)和蛋白酶活性(1387.6 U/g)。

参考文献

Pandey, A. Selvakumar, P.， Soccol, C. R.和Nigam, P.用于工业酶生产的固态发酵。自然科学进展，2004,19(4):344 - 344。
S.A.Thakur S . . N。酶:固体发酵的可持续产品开发——综述。国际工程与发展新趋势杂志。2014年第1卷第4期，第56-64页。
S. Bhargav, B. P. Panda, M. Ali和S. Javed。，Solid-state Fermentation: An Overview, Chem. Biochem. Eng. Q. 22 (1) 49–70, 2008.
Ellaiah P, Adinarayana K, Bhavani Y, Padmaja P和Srinivasula B一种新分离曲霉菌固态发酵生产葡萄糖淀粉酶的工艺参数优化。生物化学学报，38:615-620,2002。
Qui和Yao。“乳酸生产，稻草”，生物资源2(3)，419- 420,2007。
拉马钱德兰,美国;辛格”栏目;Larroche c;油饼及其生物技术应用综述。生物资源技术，Vol. 98, No. 10, pp. 2000-2009, 2007。
罗迪卡·卡普里塔，a·卡普里塔。豆粕品质化学分析方法的研究。中国农业兽医学院学报，第52卷，p. 562-565,2009。
雷纳，R. D. R.克兰丁宁，A. R.罗宾利。水分对豆油粕过热损伤的影响。幼禽。科学32:582-585,1953。
沃尼克，R. E.和J. O.安德森。限制生长中的鸡在豆粕中的必需氨基酸和热量对必需氨基酸的影响。幼禽。科学，47:281-287,1968。
阿拉巴，M.和N. M.戴尔。KOH溶解度作为豆粕过度加工指标的评价。幼禽。科学通报，1999,19(4):457 - 457。
李，H.和J. D.加利希。过熟豆粕对鸡性能和氨基酸利用率的影响。幼禽。科学通报，1992:489 - 489。
帕森斯，C. M.桥本，K. J.韦德金德，Y.韩和D. H.贝克。过度加工对豆粕中氨基酸和能量有效性的影响。Poult.Sci。71:133 - 140。1992.
戴尔瓦勒，f.r.:大豆蛋白的营养品质受加工影响，j。石油化学。SOC。，58:419, 2000.
热对水貂和雏鸡豆粕营养特性和蛋白酶排泄的影响，Nutr。众议员Int。，3.2:479, 1985.
w·a·多齐尔三世和j·b·赫斯。豆粕质量与分析技术，《大豆与营养》www.intechopen.com 111-125 DOI: 10.5772/ 1008,2011。
利用EVOP析因设计技术优化阿瓦莫曲霉在单生物反应器中生产淀粉酶和蛋白酶。食品技术，生物技术，44:257-261,2006。
C. Ganesh Kumara, Hiroshi Takagi，微生物碱性蛋白酶:从生物工业的角度来看，生物技术进展17,561-594,1999。
一种耐碱热的胞外蛋白酶，来自新分离的链霉菌sp. DP2。生物技术学报，28,725-732。doi: 10.1016 / j.nbt.2011.01.001, 2011年。
Phadatare SV, Srinivasan MC, Deshpande VV。高活性冠状孢子菌碱性蛋白酶(ncl86。8.20);酶的生产和与商业洗涤剂的兼容性。酶活。技术科学，15:72-76,1993。
Jarun Chutmanop, Sinsupha Chuichulcherm, Yusuf Chisti和Penjit Srinophakun。利用农用工业基质水稻酵母生产蛋白酶。中国生物工程学报(自然科学版)，2008(3):344 - 344。
王志强，王志强，王志强，等。大豆壳与麦麸混合固态发酵中纤维素水解酶体系的研究。生物化学学报，30(4):344 - 344,2010。
Vadlani P. V.， Madl R.， Chen L.， and O 'Brien, D.利用微生物培养提高大豆碳水化合物和动物饲料外壳的营养价值2011。
Shafique S.， Asgher M.， Sheikh m.a.，和Asad M.J.香蕉秸秆固态发酵外葡聚糖酶生产;农学通报，2004，(6):488- 491。
Shaista Kokab, Asghar M.， Rehman K.， Asad M.J.香蕉皮的枯草芽孢杆菌生产α -淀粉酶的生物处理;国际农业与生物学报。5:36 - 39,2003。
Sharanappa A, K.S.Wani, Pallavi Patil。固体发酵法生产-淀粉酶的食品工业废弃物生物处理。国际先进生物技术与研究杂志第2卷，第4期，pp 473-480, 2011。