鳞翅果叶中的木脂素。鳞翅目植物及其对大利什曼原虫的生物学活性

摘要

本品为鳞草属植物的叶片。分离出一种新的芝麻型木脂素鳞状木脂素。它的结构是由光谱最后通过x射线进行测定晶体分析。评价了从该植物中分离得到的新木聚糖及其相关化合物(+)-aptosimon、(+)-芝麻素和(+)-paulownin的抗利什曼原虫活性。

关键字

Meliosma lepidotassp。squamulata，沙柏科，木脂素，抗利什曼虫活动

简介

Meliosma lepidota布卢姆ssp。squamulata(汉斯)Beusekom (Syn。m . squamulata是一种高大的常绿乔木，属于沙柏科。然而，在国际植物名称索引中，Meliosma目前，这些物种被划分在沙蕨科，而最新的分类学出版物则观察到经典的分类单元沙蕨科[1］．沙柏科包括五大属约一百种m . lepidotassp。在奄美列岛、冲绳列岛、台湾及华南地区野生生长[2］．这种植物也被称为蝴蝶幼虫的饲料植物，Dichorragia nesimachus．利什曼病是一种在热带和亚热带部分地区发现的寄生虫病。它被列为一种被忽视的热带病。利什曼病是由感染利什曼虫寄生虫这种病毒是由白蛉叮咬传播的。最常见的形式是皮肤利什曼病，包括皮肤溃疡和内脏利什曼病。目前还没有关于该植物成分的报道，其药用价值也不确定。本文介绍了植物的分离工作及分离出的木脂素的生物学测定。

结果与讨论

从叶的MeOH提取物的乙酸乙酯可溶性部分m . lepidotassp。squamulata与已知的3种木脂素(+)-aptosimon (2) [3.，4]，(+)-芝麻素(3)[5，6]和(+)-paulownin (4) [7]，一种已知的二萜，ribenol (5) [8]，四个已知三萜烯、甲酚酸(6)[9]、处女酸(7)[10]， 1-氧-红二醇(8)[11]，以及山楂酸(9)[7) (图1)．

Meliosmin 1， [α]²⁵_D-21.2为无色针状，高分辨率(HR)-电喷雾电离(ESI)-质谱数据m/z: 407.0739，显示其元素组成为C_20.H₁₆O₈．红外光谱显示羟基的吸收最大值(3463 cm)^－1)，一个酮羰基(1776厘米)^－1)和芳香环(1609和1502厘米)^－1)，在237和281 nm处的紫外吸收带表明存在芳香环。在¹H-NMR谱，两组三个芳香族质子在ABX体系中耦合，两个单线态质子每个相当于两个质子，以及五个脂肪族亚甲基或甲基质子(表1)．的¹³C-NMR光谱数据显示两个二甲基碳信号和两个芳香环的12个共振，其余6个信号包括一个二甲基碳、两个甲基氧基碳、一个甲基氧基碳、一个氧合叔碳和一个羰基碳信号(表1)．根据上述证据，假设化合物1具有芝麻素型木脂素框架。的¹H -¹H相关谱显示4个质子为一个序列，即- och - ch₂O-，一个质子在δ处共振_H5.07 (s)必须位于隔离位置。因此，美利生素的平面结构有望如图所示图1．对二氧双环辛烷核心的平面结构和取代基的相对构型进行了确认x射线晶体学分析和ORTEP图显示了1 (图2)．1的绝对构型与相关化合物(+)-aptosimon [Δε (nm) +2.06(241)和+1.45(289)](2)、(+)-sesamin Δε(nm) +1.63(224)和+1.04(287)](3)和(+)-paulownin [Δε (nm) +2.15(239)和+2.14(285)](4)相同，均从该植物中分离得到，在CD光谱中285 nm和230 nm附近表现出正向棉花效应。一种对点取代化合物苯乙烯木内酯B(10)，因此在适当波长([θ])显示出负棉花效应。₂₃₅-459.5和[θ]₂₈₀-255.9) (12］．因此，1的结构被阐明如下所示图1被称为美利西敏。对4株木脂素和其他分离株进行了抗利什曼虫以及细胞毒活性。

结论

从树叶中m . lepidotassp。squamulata其中，芝麻素型木聚糖(1)与(+)-aptosimon(2)，(+)-三种已知木聚糖(1)分离得到芝麻素(3)和(+)-paulownin(4).结构1首先通过光谱鉴定，然后通过x射线晶体学和CD光谱分析进行了确认。从黄荆中分离出一种密切相关的化合物，黄荆素A [13］．新木聚糖(1)在8′位置上有一个羟基，而黄木素a是8′位置上的羟基异构体。

对四种木脂素和另外五种已知分离物进行了抗利什曼虫对A549人肺腺癌上皮细胞(表2)．虽然新木聚糖(1)没有表现出任何活性，(+)-泡桐素(4)表现出中等的抗活性利什曼虫IC活动₅₀=23.7±7.4 μM，但未见任何异常细胞毒性在100 μM (表2)．因此，(+)-泡桐素(4)有望成为一种很有前途的选择性抗-利什曼虫这意味着分子的作用点不是在细胞周期的共同事件上，而是在生命周期的某个阶段上原生动物．二氧双环[3.3.0]辛烷环上需要一个电负性取代基才能表现出一定的活性，但两个取代基会降低活性。已知化合物(6-9)一般不活跃利什曼虫而化合物5表现出轻微的抗利什曼虫IC活动₅₀= 64.1μM。

实验

植物材料

的叶子m . lepidotassp。squamulata标本于2006年7月采集于日本冲绳kunigami郡，凭证标本保存于广岛大学生物医学科学研究生院药物学标本室(06-MLS-Okinawa-0703)。

一般实验程序

熔点用Yanagimoto微熔点仪测量，未校正。旋光度用JASCO P-1030偏振计测量。红外光谱和紫外光谱分别用堀叶FT-710和JASCO V-520紫外/可见分光光度计测定。¹H - - -¹³以四甲基硅烷为内标，分别在400 MHz和100 MHz的JEOL α-400光谱仪上进行C-NMR谱。在JASCO J-720型分光光度计上获得CD光谱。应用生物系统QSTAR XL系统ESI(纳米喷雾)质谱进行正离子HR-MS。

硅胶CC和反相[十八烷基硅烷化硅胶(ODS)]开放CC分别在硅胶60 (Merck, Darmstadt, Germany)和Cosmosil 75C18-OPN (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)上进行。高效液相色谱法采用ODS色谱柱(Inertsil;GL Science, Tokyo, Japan)，用254 nm的紫外检测器和折射率监测器监测洗脱液。

提取与分离

的叶子m . lepidotaspp。squamulata(8.80 kg)用MeOH (4.5 L × 3)在室温下提取3次，真空浓缩至3 L。浓缩提取物用正己烷(3 L, 41.0 g)洗涤，然后将MeOH层浓缩成胶状物质。后者悬浮在水中(3 L)，然后用乙酸乙酯(3 L)提取，得到104.0 g乙酸乙酯可溶性部分。用1-BuOH (3 L)提取水层，得到1-BuOH可溶性部分(125.0 g)，剩余水层浓缩得到198.0 g水溶性部分。

乙酸乙酯可溶部分(104.0 g)被置于硅胶(300 g) CC和正己烷(C₆H₁₄)和EtOAc [C₆H₁₄(3 L)， C₆H₁₄-乙酸乙酯(20:1,3 L)， (10:1, 3 L)， (5:1, 3 L)， (2:1, 3 L)， (1:1, 3 L)，和(1:2,3 L)]，乙酸乙酯(3l)，乙酸乙酯丙酮(1:1,3 L)，丙酮(3l)， MeOH (3l)，收集3-L馏分。用ODS CC (Φ=3.5 cm, L=20 cm)和H分离馏分4的残渣(3.07 g)₂O-MeOH [(9:1, 1 L)， (17:3, 1 L)，(4:1。1 l)，(3:1。1 L) (7:3, 1 L), (3:2, 1 L), (1:1, 1 L), (2:3, 1 L)(三1 L), (1:4, 1 L)和(1:9,1 L)], 1 L分数被收集。从馏分10中，得到30.1 mg的5晶体。用ODS CC (Φ=3.5 cm, L=20 cm)和H分离馏分5中13.6 g的残渣₂O-MeOH [(9:1, 1 L)， (17:3, 1 L)，(4:1。1 l)，(3:1。1 L) (7:3, 1 L), (3:2, 1 L), (1:1, 1 L), (2:3, 1 L)(三1 L), (1:4, 1 L)和(1:9,1 L)], 1 L分数被收集。用高效液相色谱法(Φ=10 mm, L=25 cm;H₂O-acetone 17;流速:2.8 mL/min)给予10.6 mg的4从高峰在10.0分钟。用HPLC法(Φ=10 mm, L=25 cm;H₂O-acetone十七33;流速:2.8 mL/min)，分别从15.0 min, 20.0 min和24.0 min的峰值中得到17.4 mg的1,19.1 mg的2和27.6 mg的3。

用ODS CC (Φ=3.5 cm, L=20 cm)和H分离馏分6中14.1 g的残渣₂O-MeOH [(9:1, 1 L)， (17:3, 1 L)，(4:1。1 l)，(3:1。1 L) (7:3, 1 L), (3:2, 1 L), (1:1, 1 L), (2:3, 1 L)(三1 L), (1:4, 1 L)和(1:9,1 L)], 1 L分数被收集。用高效液相色谱法(Φ=10 mm, L=25 cm;H₂O-acetone 34:66;流速:2.8 mL/min)，分别从21分钟、32分钟和37分钟的峰值中给出10.4 mg的6,45.0 mg的7和43.7 mg的8。

用ODS CC (Φ=3.5 cm, L=20 cm)和H分离馏分7的残渣(12.6 g)₂O-MeOH [(9:1, 1 L)， (17:3, 1 L)，(4:1。1 l)，(3:1。1 L) (7:3, 1 L), (3:2, 1 L), (1:1, 1 L), (2:3, 1 L)(三1 L), (1:4, 1 L)和(1:9,1 L)], 1 L分数被收集。用高效液相色谱法(Φ=10 mm, L=25 cm;H₂O-acetone 32:68;流速:2.8 mL/min)给予13.0 mg的9从22分钟的峰值。

Meliosmin

无色针;mp。105 - 108°C;(α)²⁵_D-21.2 (c0.34, CHCl_3.);红外ν_马克斯(电影)厘米^－1: 3463、2892、2781、1776、1609、1502、1448、1249、1038、930、757;紫外线λ_马克斯日志(甲醇)纳米(ε):281 (2.73),237 (2.87),208 (3.04);1H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆)和13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6):表1；CD(甲醇)Δε(nm): + 2.15 (239) + 0.36 (285) (c 2.37×10⁵米);HR-ESI-MS(正离子模式)m/z: 407.0739 [m +Na]⁺(Calcd for C_20.H₁₆O₈拿拿淋:407.0737)。

苦楝素的x线分析(1)

选用合适的晶体(0.27 mm × 0.22 mm × 0.10 mm)进行分析。数据使用Bruker SMART APEX II Ultra CCD衍射仪获得，使用石墨单色MoKα辐射(λ=0.71073 Å)。该结构采用SHELXTL-97程序直接求解[14］．利用SHELXTL-97进行了细化和所有进一步的计算。采用SADABS程序进行吸收校正[15］．H原子包含在计算位置，并使用SHELXTL默认参数作为骑乘原子。晶体数据:C_20.H₁₈O₉M = 402.34,单斜,P2 (1) = 10.1257 (17), b = 7.6121 (13), c = 12.426(2),β= 107.0868(18)°,V = 915.4 (3)^3.， t =296 k, z =2, d_c=1.460克厘米³， μ(MoKα)=0.106 mm^－1， F(000)=420，在2θ<56.74°的范围内测量了5638个反射，3381是唯一的，用于所有计算。F的最终拟合优度²为1.067，最终R指数为R₁=0.0338, wR₂=0.0895，根据I>2σ(I)， R₁=0.0365, wR₂=0.0915与所有数据。峰洞差异最大，分别为0.280和-0.179 eų,分别。CCDC沉积物(编号1061064)包含补充的晶体学数据。

反利什曼虫活动

的反利什曼虫通过比色细胞活力3-(4,5-二甲基噻唑-2 -基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)法测定对促马殖子的主要活性[16］．在添加10%热灭活胎牛血清和100 μg/mL卡那霉素的M199培养基中培养对数生长期的促孕体。1 μL样品溶液(DMSO)和L. major cells (1 × 10⁵在96孔板的每孔中加入100 μL培养基中的细胞/孔)，然后在27℃常温下孵育48小时。然后每孔中加入MTT (100 μL)溶液，继续孵育24小时。然后将MTT还原后的甲醛产物溶解在DMSO中，使用Molecular Devices Versamax可调微孔仪测量吸光度。DMSO作为阴性对照两性霉素B作为阳性对照。实验一式三次。反利什曼虫主要活性被确定为在540 nm还原染料的控制吸光度的百分比。抑制活性计算为:

% =(1 -(抑制_测验——一个_空白) / (_控制——一个_空白)×100

一个_控制对照的吸光度(DMSO) well, A_测验测试井的吸光度_空白无细胞孔的吸光度。

对A549肺的细胞毒活性腺癌

用MTT比色细胞活力测定肺腺癌细胞的细胞毒活性。A549肺腺癌购自日本研究生物资源细胞库。A549细胞在添加10%热灭活FCS、卡那霉素(100 μg/mL)和两性霉素B (5.6 μg/mL)的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。

1 μL样品溶液(DMSO)和癌细胞(5 10^3.在96孔板的每孔中加入100 μL培养基，在5% CO下37℃孵育₂然后向每个孔中加入MTT (100 μL)溶液，继续孵育1小时。使用Molecular Devices Versamax可调谐微板阅读器在540 nm处测量每个孔的吸光度。DMSO作为阴性对照，阿霉素作为阳性对照。细胞毒活性计算为:

% =(1 -(抑制_测验——一个_空白) / (_控制——一个_空白)×100

一个_控制对照的吸光度(DMSO) well, A_测验测试井的吸光度_空白无细胞孔的吸光度。

确认

作者感谢广岛大学生物医学和健康科学研究生院分子医学分析中心和生命科学分析中心的超导NMR仪器和HR-ESI-MS。这项工作得到了日本教育、科学、体育、文化和技术部、日本科学促进协会[no . 22590006, 23590130和15H04651]和武田科学基金会的支持。

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