关键字 |
| 无环鸟苷、p-Toluenesulfonicacid、方法验证、LC / MS / MS,跟踪分析 |
介绍 |
无环鸟苷的化学名称是2-amino-1 9-dihydro-9 - [(2-hydroxyethoxy)甲基]6 h-purine-6-one,(或)9 - [(2 -
hydroxyethoxy)甲基]-鸟嘌呤。它的分子式是C8H11N5O3,分子量225.21克/摩尔[1]。
阿昔洛韦是一种有效的抗病毒剂用于治疗单纯疱疹病毒(HSV)感染。无环鸟苷
发挥其抗病毒活性的竞争性抑制病毒DNA,通过选择性绑定HSVthymidine的无环鸟苷
激酶约200倍大的亲和力比哺乳动物酶[2]。 |
制药基因毒性杂质(PGIs)可能诱发基因突变、染色体断裂(重组)和
他们有可能导致癌症在人类[3 - 4]。因此,暴露在低水平中杂质存在
最后的活性药物成分(API)可能显著toxicol重要的[5]。因此它是重要的
化学家们避免这样的基因毒性杂质在生产过程过程[6]。但是很难
不可能完全消除PGIs的合成方案。因此分析这是一个巨大的挑战
化学家开发一个适当的分析方法准确地量化杂质和控制他们的水平
api。根据欧洲药品评价局(EMEA)和反馈来自美国食品和药物
管理局(USFDA)毒理学关心的提议使用一个阈值(TTC),它是不会接受的
杂质将被限制在每日剂量的1.0 - -1.5μg /天(7 - 8)。 |
虽然p-Toluenesulfonicacid是一种已知的致癌物,这个数据将确定监管当局可能
将控制药物p-Toluenesulfonicacid 1.5 ppm的物质水平。p-Toluenesulfonic酸是
用作counter-ions基本药物的合成药物在制药行业,因为它的物质
强酸性、亲水特性[9]以及催化剂体系是一个有机的字符[11]。它有
广泛应用对氧化降解[12],酯的酯基转移作用[13],羧基酯化
酸[14],醛和酮的还原胺[15]以及反应中介[16]。利用
醇的合成反应或盐的形成步骤可能导致相应的烷基甲苯磺酸盐的形成,这是潜在的和已知基因毒性杂质[17]。一个能够如此低水平的方法
检测是巨大的挑战为控制这些基因毒性杂质分析方法开发。这是
认为有必要开发一种检测方法,同时量化p-Toluenesulfonicacid和无环鸟苷
在API通过质/ MS -模式。液相色谱方法开发和验证使用
生物利用度和生物等效性研究。已报告的一些分析方法等无环鸟苷
luorescence(18 - 20)直接紫外[21]和HPLC-MS [25]。在众多已报告的高效液相色谱方法
估计的无环鸟苷制药配方据报道(保险)。在色谱技术;
反相高效液相色谱(RP)是广泛用于分析。本研究涉及的发展质/女士
方法使用简单的流动相是敏感和快速量化的杂质以及无环鸟苷
后续开发的验证方法根据我引导线[35]。我们所知不
发布方法可供p-Toluenesulfonicacid和无环鸟苷API使用的同时测定
质/女士。这种方法提供了高度的精度、准确性、灵敏度和稳定性通过简单的液体-液体
基于液相色谱分离提取和检测在负模式electro-spray串联质量
谱分析。 |
本研究开发一个敏感和快速进行LC / MS / MS法测定p -
Toluenesulfonicacid阿昔洛韦的API。由于其较高的选择性和灵敏度采用LC / MS / MS
量化的p-Toluenesulfonicacid阿昔洛韦是一种有效的抗病毒剂,这是有用的治疗
单纯疱疹病毒(HSV)感染。 |
材料和方法 |
材料 |
甲醇的高效液相色谱级从默克公司购买(印度孟买)。分析级醋酸铵,高效液相色谱法
级水从默克公司购买(印度孟买)。水用于质/ MS分析准备
毫问水净化系统采购从微孔(印度班加罗尔)。参考物质p -
Toluenesulfonicacid得到从σ-奥尔德里奇(圣路易斯,美国)。 |
准备股票和标准的解决方案 |
p-Toluenesulfonicacid准备的主要股票的解决方案在10毫克/毫升的杂质在100毫升的稀释剂。进一步
稀释0.001毫克/毫升,稀释剂和稀释剂进一步达到0.000015毫克/毫升。最终浓度稀释1.5
ppm工作解决方案获得校准曲线。 |
方法 |
方法开发和优化 |
色谱条件进行了优化,尤其是流动相的组成,通过
几个试验达到对称分析物的峰形状的山峰,以及短期时间和低成本。决议
负模式无环鸟苷是通过使用甲醇作为流动相的有机成分。分离是
尝试使用甲醇和缓冲的各种组合和不同内容的每个组件在不同
列C18和C8的不同使得像海波西尔BDS列和对称列。最后对称
列被发现给最好的色谱分辨率0.4毫升/分钟的流量和8的总运行时间
分钟。p-Toluenesulfonicacid和无环鸟苷在4.06和2.10分钟时就筛选了选择离子监测(SIM)
模式。包含5毫米醋酸铵代替纯水增强的响应和改进
再现性。 |
仪表 |
高效液相色谱操作条件 |
一个日本岛津公司LC-20广告系列高效液相色谱系统(日本岛津公司公司,日本京都)被用来注入15μl整除
处理样品的对称C-18 (150 X 4.6毫米,3.5μm),这是保持在30±2°C的温度。的
流动相,5毫米ammoniumacetate和甲醇的混合物(70:30 v / v)是0.45μm过滤膜
过滤器(美国微孔或同等),然后脱气超声5分钟和0.4毫升/分钟的流量交货
进入质谱仪电喷雾电离室。 |
质谱操作条件 |
实现定量与MS-MS检测使用应用生物系统(AB SCIEX) api - 4000质量
光谱仪(福斯特城、钙、美国)配备Turboionspray™接口在400ºC。MS / MS方法包括
消极的模式。离子喷雾电压是-4500 V。源参数即离子源气体GS1, GS2
和喷雾器气体在35岁,分别为30日和13 psi。复合参数viz. declustering潜力
入口(DP)和潜在的设定在-53和-10 v。选择离子监测(SIM)模式作为女士的方法
p-Toluenesulfonicacid量化的阿昔洛韦药物物质。在这种方法中p-Toluenesulfonicacid
监控与分子离子(mh) + 171.2 m / z (deprotonated)和无环鸟苷与其分子离子监测
(mh) + 224.2 m / z (deprotonated)。分析获得的数据处理分析软件™(1.5.1版本)。 |
结果与讨论 |
方法验证 |
特异性和选择性 |
特异性的能力方法评估明确的组件的分析物反应的存在
会出现在示例。阿昔洛韦和p-Toluenesulfonicacid化合物解决方案准备
单独的浓度为0.01 mg / mL的稀释剂和无环鸟苷掺入了p -一个解决方案
Toluenesulfonicacid也准备好了。特异性建立了注射阿昔洛韦飙升的杂质
在没有干扰。空白和特异性色谱图见图1 (a)、(b)。 |
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鲁棒性 |
开发方法的鲁棒性是轻微的和深思熟虑的研究实验条件的变化。的
流动相的流速变化的影响(-2% + 2%),而其他流动相组件的数量
保持不变,柱温箱温度(2°C + 2°C)我。在28ºC和e 32ºC缓冲单元进行了研究。 |
LOD测定和定量限 |
LOD和定量限、灵敏度的测量方法,计算从S / N比率(信号噪声)。来确定
LOD和定量限值顺序p-Toluenesulfonicacid浓度减少,这样他们的收益率S / N
比率分别为3.2和10.1。决定LOD和定量限色谱图2所示(一个),(b) . data
来自六个注射(没有API)包含1.5 ppm的每个p-Toluenesulfonicacid对一个
API样品浓度10毫克/毫升。1.5 ppm是典型的定量限p-Toluenesulfonicacid, LOD
大约三次不到定量限。此外,SIM的相对效率模式灵敏度提高
也被评估。 |
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恢复的研究 |
恢复研究的标准添加法进行评估的准确性和特异性,因此
方法的准确性决定在散装水平定量限药物样品一式三份。复苏的
计算。优秀的复苏p-Toluenesulfonicacid值98.56 - 99.35。在这样一个低
这些复苏和% RSD为< 1.0水平是令人满意的。样品在色谱图所示定量限和精度
图3 (a)、(b)和相对标准偏差RSD为百分比计算的平均一式三份分析
表1所示。进一步发现p-Toluenesulfonicacid 48小时的稳定和稳定的
杂质在不同的时间间隔呈现在表2。 |
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线性和范围 |
方法的线性测试是根据我的指导方针执行。该方法评估
6个不同浓度的分析物的范围在1.5 - 13.5 ng / mL。这些标准解决方案准备
通过合适的稀释股票的解决方案与移动阶段。阴谋被评估使用的线性最小二乘
线性回归分析通过选择离子监测(SIM)。的线性p-Toluenesulfonicacid是令人满意的
建立与定量限6点之间的校准曲线,分析物浓度的150% (40%,60%,80%,100%,
120%和150%)。校准曲线是由策划p-Toluenesulfonicacid一式三份的平均值
注射浓度用百分比表示。斜率、截距和相关系数值
来自线性最小二乘回归分析和表2中给出的数据。这表明,好
之间的相关性存在p-Toluenesulfonicacid浓度峰值区域。可重复性检查了
计算相对标准偏差(%相对标准偏差)的6个决定注射6个刚做好的解决方案
包含p-Toluenesulfonicacid和1.5 ppm的同一天。%相对标准偏差值确认好精度低
发达的方法。表3。 |
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结论 |
发展现状的研究是基于高度敏感的验证,具体的、可再生的和高吞吐量
质/ MS方法量化p-Toluenesulfonicacid的api。它已经建立了高度
敏感的检测极限(LOD) 0.5 ppm的跟踪等级醋酸铵加入流动相
增强电离和检测。选择样品溶剂效应的评估标准和稳定
不存在的API。作为一个系统的方法,它利用综合色谱是很重要的
知识的整个生命周期内的发展基于连续理解药物候选
API的制造过程。能够量化的方法在ppm水平开发和验证。
我们可以得出结论,监控的开发方法可以非常有用的p-Toluenesulfonicacid无环鸟苷
在纯和平板形式。 |
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