紫皮色素对1型和2型糖尿病降血糖和抗氧化作用的比较研究

摘要

背景:糖尿病(DM)是世界上五大死因之一，每分钟约有6人死于糖尿病并发症。紫锥花色素是一种具有高抗氧化和降糖活性的类醌类色素。目的:比较刺青色素对1型和2型糖尿病大鼠的降糖和抗氧化作用。方法:36只雄性Wistar白化大鼠分为1型糖尿病组和2型糖尿病组。每主组又分为3个亚组(6只/亚组);对照组、糖尿病组和青皮色素治疗组。1型糖尿病采用单剂量链脲佐菌素(60 mg/kg, ig)诱导，2型糖尿病采用高脂饮食诱导，4周后注射链脲佐菌素(30 mg/kg, ig)。处理组每天给予棘皮色素(10% DMSO中1 mg/kg体重)，连续4周。结果:棘皮色素可改善糖尿病标志物、肝功能、血脂、肾功能及抗氧化系统，其中T1DM组改善更为明显，T2DM组改善葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、γ-谷氨酰转移酶和谷胱甘肽水平降低更为明显。结论:乙酰胆碱的降糖作用在T1DM中更为明显，提示乙酰胆碱的降糖机制可能涉及改善葡萄糖代谢、恢复β细胞、改善胰岛素分泌和抗氧化活性。 The cells in T1DM prefer pathway of glycolysis, while in T2DM the cells prefer pentose pathway.

关键字

糖尿病，胰岛素抵抗，紫斑色素，肝脏，肾脏。

介绍

糖尿病是全球五大死因之一，每分钟约有六人死于糖尿病并发症[1]。全球糖尿病发病率逐年上升，糖尿病患者人数将从2013年的3.82亿人增加到2035年的5.92亿人[2]。

大多数糖尿病患者为2型糖尿病(T2DM)，相对少数比例(7-10%)的糖尿病患者患有1型糖尿病(T1DM) [3.]。T1DM是一种导致胰腺β细胞破坏的自身免疫性疾病[4]。在过去的几十年里，T1DM的发病率总体上以每年3% ~ 5%的速度增长，据估计每年有65000例儿童新发病例[5]。另一方面，2型糖尿病是一种更为普遍的糖尿病，占糖尿病患病率的90% [6]。它主要是由于胰岛素抵抗和产生胰岛素的胰腺β细胞功能障碍，导致胰岛素分泌不足[7]。

在实验动物中，糖尿病研究中最突出的致糖尿病化学物质是链脲佐菌素(STZ) [8]。STZ对β细胞有选择性毒性作用[9]因为对β细胞膜有很高的亲和力[10]， β-细胞清除自由基的能力低[11]，低NAD⁺/胰岛的DNA比率[10]。STZ可诱导T1DM的某些典型特征，如高血糖、低胰岛素血症和体重下降[12]。高剂量STZ (60 mg/kg体重)实验性诱导T1DM，导致β细胞快速破坏，血浆胰岛素水平严重下降，高血糖。13]。本研究中严重的高血糖和低胰岛素血症可能与胰腺细胞的破坏有关，组织病理学检查证实了这一点。另一方面，通过高脂肪饮食(HFD)和低剂量STZ治疗(引起最初的β细胞功能障碍和随后的直接高血糖)相结合，模拟了动物的T2DM [14]。HFD可通过不同机制诱导胰岛素抵抗，但主要通过Randle或葡萄糖-脂肪酸循环[15]。过量脂肪摄入导致的高甘油三酯水平的存在可能构成脂肪酸可用性和氧化增加的来源。优先使用增加的脂肪酸进行氧化，使胰岛素介导的肝脏葡萄糖输出的减少变得迟钝，减少了骨骼肌对葡萄糖的摄取或利用，导致代偿性高胰岛素血症，这是胰岛素抵抗的一个共同特征[16]。胰岛素抵抗后，胰岛β细胞的分泌能力补偿胰岛素抵抗的降低，而这实际上是通过注射低剂量STZ导致低胰岛素血症来实现的[j]。16]。

胰岛素治疗是糖尿病治疗中唯一令人满意的方法，但在慢性治疗中存在胰岛素抵抗、厌食症、脑萎缩、脂肪肝等缺点[17]。口服降糖药能够降低血糖水平，属于两类化学物质;磺脲类及双胍类[18]。然而，口服抗糖尿病药物的使用受到限制，因为它们的不良副作用包括血液、皮肤和胃肠道反应、低血糖昏迷和肝肾功能紊乱。此外，它们不适合在怀孕期间使用[19]。无任何副作用的糖尿病管理对医学界来说仍然是一个挑战，因此迫切需要具有抗糖尿病活性和较少副作用的天然产品[20.]。

海洋生物是生物活性天然产物的极好来源[21]。从各种海洋动物中提取了许多生物活性化合物[22]。大多数具有药理活性的次生代谢物已从棘皮动物中分离出来[23]。从海胆(棘皮动物门，棘皮总纲)中发现新的抗生素有许多有价值的信息，这些信息对其生物活性化合物有了新的认识[24]。海胆P. lividus是大西洋和地中海沿岸广泛分布的一种海胆，在几个国家受到密集的商业捕捞[25]。它有许多独特的物质，如被称为spinochromes的醌类色素[26]。从这些化合物中，海胆色素(Ech)具有很高的抗氧化活性，是海胆壳、棘和卵中最常见的暗红色色素[27]。

材料与方法

化学品和试剂

链脲佐菌素、二甲基亚砜(DMSO)、胰岛素和己糖激酶试剂盒购自Sigma-Aldrich (St. Louis)。生化试剂盒购自Biodiagnostic Company (El Moror St, Dokki, EGY)。

海胆收藏

海胆(p . lividus)是从地中海沿岸的亚历山大港(埃及)收集的，然后用冰包装运到实验室。样本用海水彻底清洗，以清除收集地点的沙子和过度生长的生物，然后运往实验室。收集的标本根据分类指南的标准文献进行鉴定[28]。收集到的标本立即阴干。

紫皮色素(Ech)提取

用Amarowicz方法对壳和棘中的色素进行了轻微的修饰[29，30.]。取出内脏后，用冷水冲洗壳和棘，在4°C下黑暗风干2天，然后研磨。粉末(5 g)通过逐渐加入10 ml的6 M HCl溶解。用相同体积的乙醚提取溶液中的色素3次。收集的乙醚层用5%的NaCl洗涤，直到酸几乎被除去。将含颜料的醚溶液在无水硫酸钠上干燥，并在减压下蒸发溶剂。含多羟基萘醌色素的提取液-30℃避光保存。

伦理批准

本研究中使用的实验方案和程序经开罗大学理学院、机构动物护理和使用委员会(IACUC)(埃及)(CUFS/F/33/14)批准。所有的实验程序都是按照国际上关于照顾和使用实验动物的指导方针进行的。

实验动物

雄性白化Wistar大鼠(鼠形)， T1DM患者体重140±10 g, T2DM患者体重80±10 g。大鼠来自国家研究中心(NRC, Dokki, Giza)。将大鼠安置在温度和湿度控制的环境中，给予食物和水随意。

诱导1型糖尿病(T1DM)

实验前，所有大鼠均被饥饿12小时，但允许自由饮水。将链脲佐菌素(STZ) 60 mg/kg溶于0.1 mol/l柠檬酸钠缓冲液，pH为4.5，腹腔注射诱导T1DM。注射STZ后72h测定血糖水平。大鼠被饥饿，但在测量血糖前有饮水6小时。本实验空腹血糖浓度≥300 mg/100 ml为1型糖尿病[31]。

诱导2型糖尿病(T2DM)

根据Reed等人的修改方案，给大鼠喂食能量为5.3千卡/克的高脂肪饮食，其中60%的热量来自脂肪，35%来自蛋白质，5%来自碳水化合物。32]。4周后，大鼠腹腔注射单剂量STZ (30 mg/kg溶解于0.1 mol/l柠檬酸钠缓冲液中，pH为4.5)。72h后空腹血糖浓度≥300mg / 100ml视为2型糖尿病[33]。

实验设计

适应1周后，36只大鼠分为两组;T1DM组18只大鼠，T2DM组18只大鼠。

T1DM组分为3个亚组(6只/亚组):

对照组:在单剂量柠檬酸缓冲液(0.1 mol/l, i.p)后，大鼠每天给予1 ml (10% DMSO，口服)，持续4周。

糖尿病组:STZ单剂量(60 mg/kg, i.p)后，大鼠每天给予1 ml (10% DMSO，口服)，持续4周。

决定自组:STZ单剂量(60 mg/kg, i.p)后，大鼠口服1 ml Ech (1 mg/kg体重，10% DMSO，口服)[34每天一次，连续4周。

T1DM组又分为3个亚组(6只/亚组):

对照组:正常饮食喂养4周后，大鼠注射单剂量柠檬酸缓冲液(0.1 mol/l, i.p)，然后每天口服1 ml (10% DMSO，口服)，连续4周。

糖尿病组:HFD喂养4周后，大鼠注射单剂量STZ (30 mg/kg, i.p)，然后每天给予1 ml (10% DMSO，口服)，连续4周。

决定自组:HFD喂养4周后，大鼠每天注射单剂量STZ (30 mg/kg, ig)，然后每天注射1 ml Ech (1 mg/kg, 10% DMSO，口服)，连续4周。

体重测定

在实验开始和结束时测量体重。

处理动物及收集标本

3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，开胸。一根针穿过隔膜进入心脏。一旦心脏被刺穿，就轻轻地施加负压，并根据需要重新放置针头，直到血液流入注射器。取大鼠血液离心(3000转/分，15分钟)分离得到血清，-80℃保存用于生化测定。

生物化学分析

采用Freund等方法测定血清葡萄糖[35]，血清精氨酸酶[36]，肝脏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[37]，血清胰岛素[38]、血清天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT) [39]、血清碱性磷酸酶(ALP) [40]、血清γ-谷氨酰转移酶(GGT) [41]、血清总蛋白[42]，血清白蛋白[43]，血清总脂[44]，血清甘油三酯[45]，血清总胆固醇[46]、血清低密度脂蛋白[47]和血清高密度脂蛋白[48]，血清肌酐[49血清尿素[50]和血清尿酸[51]根据制造商的说明使用光谱诊断和生物诊断试剂盒(吉萨，埃及)进行测定。

MDA水平是脂质过氧化的一个指标，由Ohkawa等人估算[52]，还原型谷胱甘肽[53]、一氧化氮[54]和过氧化氢酶(CAT) [55根据制造商使用生物诊断试剂盒(吉萨，埃及)的说明，在肝脏匀浆上清中测定。

统计分析

改善百分比用于比较Ech对两种糖尿病的治疗效果。只取正值，由下式计算:

结果

糖尿病标记

数据记录于图1结果表明，除G6PD对T2DM的改善作用外，Ech对T1DM的改善作用高于G6PD。

肝功能

我们的数据见图2表示，除GGT对T2DM的改善作用外，Ech对T1DM的肝酶改善作用高于T2DM。

血脂

图3结果显示，与T2DM相比，1dm患者在接受Ech治疗后血脂水平的改善更明显。

肾脏功能

根据图4T1DM组的肾功能改善明显高于T2DM组。

氧化应激标志物

数据记录于图5结果表明，除谷胱甘肽(GSH)在T2DM中高于T1DM外，Ech在T2DM中降低氧化应激的效果均高于T2DM。

讨论

枸杞的降糖和抗氧化作用已在以往的研究中得到证实[56]。研究乙酰胆碱治疗不同类型糖尿病的疗效，对其作用机制和不同类型糖尿病细胞的行为有全面的了解。在我们的研究中，给药Ech显著提高了糖尿病大鼠的血清胰岛素浓度，同时显著降低了葡萄糖浓度。乙酰胆碱对胰腺有间接作用，通过抑制乙酰胆碱酯酶导致乙酰胆碱水平升高[57]。乙酰胆碱是胰岛素释放的刺激物之一，被认为对调节胰岛细胞功能有重要作用[58]。在T2DM中，乙酰胆碱对葡萄糖和胰岛素的改善能力低于T1DM，这可能与胰岛素抵抗有关。乙酰胆碱治疗后，糖尿病大鼠血清精氨酸酶活性降低。有几种可能的解释可以解释这一结果:1)胰岛素水平的升高仅在精氨酸酶活性升高时才抑制精氨酸酶活性，如糖尿病;2)降低血浆葡萄糖浓度，抑制高血糖对血浆精氨酸酶活性的刺激作用;3)胰岛素水平升高，使其他代谢因子(即血浆游离脂肪酸水平升高)恢复到正常水平，导致血浆精氨酸酶活性降低[59]。在T1DM中，乙酰胆碱提高精氨酸酶活性的能力比T2DM更明显，这可能是由于其在T1DM中具有更高的降糖活性。

在本研究中，给药乙酰胆碱引起己糖激酶活性显著增加。己糖激酶活性的增加表明糖尿病患者脂质代谢的增强向碳水化合物代谢转移，并增强了外周部位对葡萄糖的利用[60]。T1DM患者己糖激酶改善百分比高于T2DM患者，这与T1DM患者血糖水平的高改善相结合。

糖尿病大鼠肝脏G6PD活性升高。肝脏中较高的G6PD活性表明葡萄糖通过戊糖途径被利用[61]。在T2DM中，乙酰胆碱改善G6PD的能力高于T1DM。这意味着T1DM细胞在糖代谢中更倾向于糖酵解途径来补偿严重的能量减少。然而，在T2DM中，细胞更倾向于戊糖途径来补偿谷胱甘肽还原(GSH)的缺乏，作为抗氧化系统的一部分，它们有其他能量来源(高脂肪饮食中的脂肪积累)。通过测量肝脏中谷胱甘肽的活性证实了这一机制，其中T2DM患者的改善百分比更高。

治疗后血清谷丙转氨酶、谷丙转氨酶恢复到接近正常水平，进一步强化了其抗糖尿病作用。此外，我们的研究结果表明，在T1DM中，Ech改善转氨酶活性的能力更高，因为它的降糖作用高于T1DM。

乙酰胆碱能显著降低糖尿病大鼠血清ALP活性。ALP活性的降低表明其对STZ损伤的胆道功能的稳定性[62]。与AST和ALT酶一样，Ech改善T1DM患者ALP活性的能力高于T2DM患者。

在我们的研究中，给药Ech显著降低糖尿病大鼠GGT的活性。因为它通过清除自由基起到抗氧化剂的作用[63]，可降低GGT活性的活性。Ech改善T2DM患者GGT活性的能力高于T1DM患者。这种改善意味着抑制血清中酶的活性，这也意味着提高组织内酶的活性，从戊糖途径接收大量的谷胱甘肽，并通过梅斯特γ -谷氨酰循环将其转运到细胞中。

本研究用Ech治疗后，TG、TC、LDL-C浓度下降，HDL-C升高，这可能是由于葡萄糖水平适当稳定，胰岛素水平升高所致。此外，这种影响可能是由于肠道吸收减少或胆固醇生物合成减少[64]。正如预期的那样，由于T1DM患者血糖和胰岛素的显著改善，Ech治疗后T1DM患者的脂质谱改善高于T2DM患者。

通过改善糖脂代谢、增强胰岛素敏感性和抑制脂质过氧化过程来改善肾功能。在T1DM中，Ech改善肾功能的能力高于T2DM，证实了Ech在T1DM中具有较高的降糖和抗氧化活性。

口服乙酰胆碱可显著降低糖尿病大鼠肝脏MDA水平。我们的研究结果表明，乙酰胆碱可以通过多种抗氧化机制起作用，包括清除活性氧自由基[63]和抑制脂质过氧化[65]。在T1DM患者中，乙酰胆酸改善MDA水平的能力高于T2DM患者，这可能与T1DM患者胰岛素和葡萄糖水平的显著改善有关。

本研究结果表明，用Ech治疗糖尿病大鼠可使糖尿病大鼠肝脏GSH水平显著升高，这可能与调节Ech的细胞氧化还原电位有关[66]。T2DM患者GSH水平的改善大于T1DM, T2DM患者细胞更倾向于使用戊糖途径进行葡萄糖氧化。

另一方面，给予Ech的糖尿病组一氧化氮浓度显著增加。NO浓度的增加可能与精氨酸酶活性的抑制有关[67]和降低高血糖状况[68]。此外，它们还能诱导乙酰胆碱的产生[57]，刺激一氧化氮并增加血管内皮细胞产生一氧化氮[69]。在T1DM中，乙酰胆碱改善NO水平的能力高于T2DM，因为在T1DM中精氨酸酶活性和葡萄糖水平的改善更大。

结论

乙酰胆碱对T1DM的降糖作用更明显。我们建议，乙酰胆碱可以作为潜在的替代降糖药，以控制2型糖尿病的糖尿病并发症，但它可以作为补充剂与胰岛素治疗1型糖尿病。我们还注意到，T1DM细胞更倾向于糖酵解途径，而T2DM细胞更倾向于戊糖途径。

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