一种改进的样品制备方法检测恶性疟原虫的血液样本

Thavamani Rajapandi^*

自然科学学系Coppin州立大学,在马里兰州的巴尔的摩

*通讯作者:: Thavamani Rajapandi
生物学副教授
自然科学部门
Coppin州立大学
科学和技术中心204
北西部大道2500,巴尔的摩
马里兰州21216
电话:410 - 951 - 4260
电子邮件:trajapandi@coppin.edu

收到的日期:21/03/2018;接受日期:12/04/2018;发布日期:20/04/2018

文摘

显微镜仍然是黄金标准疟疾寄生虫的检测血液样本,而快速诊断测试(RDTs)和聚合酶链反应(PCR)的方法越来越多地用于应用程序领域,每个都有局限性。利用体外培养的恶性疟原虫的寄生虫隔离,我们分析了几种样品制备方法对pcr检测。测试样品受到低渗的溶菌作用,其次是几乎完全耗尽疟原虫色素(Hz)、血红蛋白(Hb)和随后的PCR扩增msp2基因导致的检测极限,提高样品准备在等渗缓冲条件下。此外,我们放大的几个目标基因,序列包括msp2——msp1 - 18 s rRNA, eba175寄生虫提取由低渗的溶菌作用。我们确定了一套引物,放大区域内eba175给予更大的探测极限1寄生虫/ 5×107红细胞(红血球),以及一套引物给msp2 1到5寄生虫的检测极限每5×107红血球通过标准的PCR分析。剩下的目标表现出最大20到30寄生虫检测限制每5×107红血球。这个新开发的方法是更敏感的100到500倍比目前pcr方法检测30到100每5×106寄生虫1μl血液中红血球)。此外,该方法可用于部署的pcr诊断领域,基因型和质量控制以及寄生虫的失败的方法。

关键字

恶性疟原虫、聚合酶链反应、快速诊断测试,疟原虫色素,寄生虫血症

介绍

pre-symptomatic检测疟原虫感染和无症状的个体的控制起着关键作用疟疾传播,治疗和抗疟疾药物的正确使用。显微观察、抗原检测的快速诊断测试(RDT)和酶联免疫吸附试验(ELISA)和核酸技术通常用于诊断目的。显微观察的Giemsa-stained血涂片是最广泛接受的实践对疟疾的诊断(1]。另一种诊断方法是RDT,基于疟原虫特定抗原的比色检测。目前,所有现场部署方法检测恶性疟原虫特定的富组氨酸蛋白2 (PfHRP-2)、乳酸脱氢酶(PfLDH),或醛缩酶(2- - - - - -4]。然而,疟疾寄生虫的检测方法需要大量的寄生虫在血液样本。RDT的最大检测极限是100每μl血液寄生虫疟原虫物种[5×10(0.001%感染⁶每μl血液红细胞)(1]。因此,人们普遍认为RDT不是最优的检测和诊断疟疾在血液样本数量有限的寄生虫。此外,假阳性结果可能由于寄生虫抗原的存在尽管寄生虫后间隙化疗。此外,目前pcr方法的检出限要求至少30到100年寄生虫1μl血液样本或5×10⁶体外培养红细胞表面收集到的寄生虫(5]。这些局限性突出需要更敏感和field-adaptable方法更好的临床样本的诊断通常寄生虫血症较低。然而,另一个考虑是最好的样品制备方法,选择合适的目标(s)核酸检测。这两个参数没有被广泛研究领域样品或样本准备从体外培养的寄生虫。我们有兴趣改善的样品制备方法和pcr诊断通过确定最优基因目标对于一个成功的检测数量非常低的疟原虫在临床样本以及RDT-failed样品作为质量控制措施。

方法

恶性疟原虫在体外文化和PCR的样品制备低渗的裂解红细胞表面和iRBCs(寄生虫感染的红细胞):恶性疟原虫文化是保持RPMI含有10%汇集heat-inactivated人类血清如前所述[6]。10μl红血球(5×10⁷红细胞表面窝藏non-detectable水平的受光的寄生虫显微镜(5 - 10寄生虫/样本)是0.5×10稀释⁸未受感染的红细胞表面(100μl 50%血)。红血球被离心收集和resuspended 0.5毫升的等张(1 x PBS)或低渗的(0.1 x PBS)缓冲区和混合的涡流。样本孵化冰面上五分钟,这种寄生虫颗粒被离心收集。寄生虫颗粒广泛用5毫升的各自的缓冲区。上层清液是仔细删除没有令人不安的颗粒和颗粒在100年resuspendedμl水和加热5分钟的95°C。样品的各种目标基因从10μl(相当于5×10⁶红细胞表面被50μl PCR反应混合放大。十μl (1×10⁶红细胞等价物)的样本分析SYBR®绿色我发现后琼脂糖凝胶电泳。

PCR扩增

铂Taq用于PCR反应是获得热费希尔科学(猫# 10966026),并与引物进行PCR中列出表1。在一个典型的PCR反应,混合准备通过添加MgSO4大师,核苷酸,1 x PCR缓冲和核酸酶游离水如前所述[5]。所需的体积混合稀释缓冲的整除为多个管包含混合引物和模板DNA。PCR反应是由ptc - 200 (MJ研究Inc .)、美国)thermocycler中列出的条件下表1对各种目标基因。十至二十μl PCR分析了放大产品的0.85% SYBR®绿色I-stained琼脂糖凝胶和拍摄使用凝胶Doc XR凝胶文档系统(Bio-Rad,猫# 1708195)。

表1。引物(表)中提供的序列用于目标基因的扩增,扩增子大小和用于PCR扩增条件。

基因的目标	引物序列5 ' 3 '	PCR条件	扩增子大小(bp)
msp2	F: ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCT 接待员:TTATATGAATATGGCAAAAGATAAAAC	1。5分钟95°C; 2。退火的58°C 2分钟 3所示。在72°C扩展了2分钟 4所示。在94°C变性1分钟。重复步骤2 - 4 30倍。	819年



eba175	F: GAGGAAAACACTGAAATAGCACAC 接待员:CAATTCCTCCAGACTGTTGAACAT	1。5分钟95°C; 2。退火的58°C 2分钟 3所示。在72°C扩展了2分钟 4所示。在94°C变性1分钟。重复步骤2 - 4 30倍。	795年



半导体存储器核糖核酸	F: TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT 接待员:ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC	1。5分钟95°C; 2。退火的58°C 2分钟 3所示。在72°C扩展了2分钟 4所示。在94°C变性1分钟。重复步骤2 - 4 30倍。	1200年

结果

恶性疟原虫PCR的检测用样品由低渗的裂解iRBCs:几种方法已广泛用于疟疾的诊断等微观评价Giemsa-stained血涂片,parasite-specific DNA序列的方法和PCR扩增。所有这些方法利用heat-inactivated样品,包括胞质内容准备从全血或溶菌产物准备parasite-infected红血球缺乏白细胞。在这项研究中,我们设计了一个改进的样品制备方法从parasite-infected血液白细胞的存在与否。简单,渗透平衡的干扰减少红细胞或导致细胞溶解。低渗的条件下(水或15毫米磷酸盐缓冲剂在pH值7.0),红细胞表面破裂,释放所有的胞质内容包括血红蛋白。在这个过程中,离心分离和胞质内容被公布的基因组材料颗粒状和膜。这个粗颗粒加热灭活潜在的核酸酶和加热样品是直接用于pcr扩增parasite-specific目标序列。测试样本由各种方法如示图1和代表样本所示。所示图1,低渗的溶解样品的0.1 x PBS(15毫米磷酸盐缓冲pH值7.0),其次是完全去除血红蛋白释放和大多数疟原虫色素的反复洗涤颗粒在0.1 x磷酸盐缓冲剂,导致更大的敏感性检测恶性疟原虫通过聚合链反应。等张裂解1 x PBS的寄生虫或低渗的溶菌作用的胞质内容相比不增加灵敏度低渗的溶菌作用结合的胞质内容(比较板1 - 12,1“-12”和“-12”图1)。PCR扩增的敏感性决定基于PCR阳性样本的百分比总数的样品测试。结果表明,100%的样本积极与低渗的裂解方法,20%的样本积极与低渗的裂解方法没有清除胞质内容发布。治疗和样品等渗缓冲PCR方法并不会产生积极的结果。

图1:恶性疟原虫PCR的检测用样品由低渗的裂解iRBC: msp2基因PCR -从扩大了多个测试样本中描述的方法部分。样品被琼脂糖凝胶电泳分析。通道1 - 12,hypotonic-lysis parasite-infected红细胞,几乎完全耗尽疟原虫色素和血红蛋白的微量离心(见方法部分);通道1‘-12’,除了parasite-infected血液悬浮在1 xpbs PCR反应混合;和车道1“-12”,添加hypotonically-lyzed溶解产物Hb和赫兹。

目标选择的敏感检测恶性疟原虫感染:几个目标分析和用于PCRbased检测和诊断疟疾,和最常用的目标是小和大亚基18 s rRNA特定序列。为了选择一个敏感目标,我们分析几个寡核苷酸引物组对多个目标基因,包括msp2, msp1、四rRNA, eba175 PCR扩增。作为第一步,我们用纯化基因组DNA(图2)作为目标材料。所示图2,我们确定了引物组特定于F或C型eba175序列(s),导致更高的检测灵敏度恶性疟原虫DNA的特定msp2和ssrRNA相比,PCR引物。eba175底漆集有可能相当于0.5标准下寄生虫PCR检测基因组DNA分析。下一个最好的目标是msp2,可能相当于一个寄生虫基因组DNA检测。剩下的目标是限制在20 - 30寄生虫基因组DNA的等价物(图2和数据未显示)。

图2:检测的目标选择恶性疟原虫感染:msp2 eba175和四核糖体rna基因放大各种浓度的纯化恶性疟原虫基因组DNA。在50μl PCR进行反应和10μl反应混合被琼脂糖凝胶电泳分析。ng巷1:2;巷2:0.2 ng;巷3:0.02 ng,巷4:0.002 ng。

的决心恶性疟原虫通过PCR检测灵敏度限制使用样本由低渗的溶菌作用:为了确定eba175和msp2引物的PCR检测极限的原油样品中获得的低渗的裂解的寄生虫,恶性疟原虫来华的红血球被连续稀释和eba175 msp2从低浓度样品由溶解而被放大。这些结果表明,引物序列设置特定于1 kb在eba175 msp2提供最敏感的诊断目的和目标适用于两种纯化基因组DNA以及原油样品来自寄生虫文化在人类基因组DNA的存在与否(图3和图3 b)(8- - - - - -10]。

图3:的决心恶性疟原虫通过PCR检测极限使用样品由低渗的溶菌作用。一个,恶性疟原虫感染红细胞从4×10被稀释⁴0.04寄生虫反应培养基或包含1×10 1 x PBS⁹未受感染的红细胞。样本由低渗的裂解方法部分中描述。eba175 (e)和msp2 (m)基因扩增的PCR - 50μl反应混合和20μl样本,通过琼脂糖凝胶电泳分析后跟SYBR®绿色我染色。B,红血球窝藏0.5毫升的血液寄生虫血症2.0%(相当于10μl包装细胞)稀释于4.5毫升的全血包含人类白细胞(相当于1×10⁹红血球或0.1毫升的包装细胞)。这种悬架是连续稀释10⁹在1×10⁹未受感染的红细胞表面。一毫升的连续稀释样本处理方法部分中所述,100年resuspendedμl的水。eba175基因PCR在扩大了50μl反应混合和20μl样本,通过琼脂糖凝胶电泳分析后跟SYBR®绿色我染色。

讨论和结论

在这项研究中,一个简单的和改进的样品制备方法使用血液样本窝藏显微镜下non-detectable疟原虫。测试样本由低渗的裂解iRBCs和几乎完全清除疟原虫色素(Hz)、血红蛋白(Hb)离心。这两个关键步骤提高了pcr检测极限的疟疾寄生虫到几棵寄生虫血症较低的血液样本。这一现象可以解释为高Hb的内容或赫兹的抑制率放大eba175和msp2基因序列(数据没有显示)。这是由我们的结果支持使用样本由低渗的裂解和删除Hb和赫兹提高检测水平。同时,样品准备在1 x磷酸缓冲它包含~ 155毫米磷酸钠提供一个等压的条件,相当于生理渗透条件和红血球和iRBCs不会溶解。高血红蛋白浓度和疟原虫色素可能会抑制PCR反应的聚合酶的活动。hyponic溶菌作用方法释放所有的血红蛋白和大多数疟原虫色素都洗出来,特别是潜在的抑制剂是移除在这个样品制备方法。这个至关重要的和简单的一步改进的敏感性检测寄生虫DNA聚合酶链反应。有趣的是,PCRbased eba175放大的影响在一个测试的样品含有大量的寄生虫,受到低渗的溶菌作用。 The selection of targets such as eba175 and/or msp2 resulted in higher levels of detection by PCR compared to other commonly used targets in previously published studies(表2)(10- - - - - -12]。应该注意的是,口译pcr诊断结果在临床样本可以问题,类似于antigen-based检测方法。这可能由于一小部分寄生虫DNA仍在感染后的血液通过抗疟药物治疗和人类基因组的大数量过剩的材料。因此,一个活跃的感染的分化从最近清除感染是值得商榷的。然而,从最近清除寄生虫疟原虫DNA的数量应该当寄生虫血症是在非探测水平几乎可以忽略不计。灵敏度级别从低浓度样品准备的裂解获得几个折叠大于先前发表的研究。因此,这种新开发的方法将有助于解决许多显微镜的诊断疟疾的挑战,方法和pcr方法。总之,这个简单的方法适应一个字段设置通过使用便携式PCR机还可以与更大的准确性。

表2。目前可用的工具来检测疟疾寄生虫和比较的样本。

方法	目标	检出限寄生虫/µl血液样本	目标和限制的描述	参考
方法	目标	检出限寄生虫/µl血液样本	目标和限制的描述	参考
显微镜	整个寄生虫	30.	检测到无性和性血液寄生虫显微镜下的所有物种阶段。	小林T [7]
显微镜	整个寄生虫	30.	可靠的数据需要熟练的显微镜化验员	小林T [7]
RDT	抗原	> 100	检测疟疾抗原检测试纸测定用针对寄生虫抗原的单克隆抗体。抗体的要求	小林T [7]
RDT	抗原	> 100	抗体的要求	小林T [7]
传统和实时PCR ()	DNA	10	放大目标寄生虫DNA。根据目标基因,属——了解诊断是可用的。传统PCR定性的结果,而qPCR 是定量的。纯化的DNA是必需的	小林T [7]



rt - pcr	核糖核酸	10	检测mRNA表达在特定的生命周期的寄生虫。测试可以用来测量感染的传播能力量化mosquito-infective的存在性阶段。	小林T [7]
rt - pcr	核糖核酸	10	纯化RNA是必需的	小林T [7]
NASBA	核糖核酸	< 1寄生虫	放大目标RNA等温条件在一个单一的步骤。纯化RNA是必需的。	小林T [7]
灯	DNA	5 - 10	放大后由浊度仪检测感染疟原虫的DNA。	小林T [7]
灯	DNA	5 - 10	DNA提取方法是关键	小林T [7]
血清学测试	疟疾寄生虫特殊抗体	> 100	疟疾寄生虫抗体检测和措施作为最近的指标和/或过去暴露于寄生虫。	小林T [7]
血清学测试	疟疾寄生虫特殊抗体	> 100	抗体所需的	小林T [7]
全血低渗的溶解	全血	寄生虫/ > < 100µl全血	eba75 和msp2	本研究

本研究中使用的制备方法。灯= loop-mediated等温扩增;NASBA =核酸序列扩增;RDT =快速诊断测试;qPCR =实时定量聚合酶链反应;rt - PCR =逆转录酶聚合酶链反应

引用

穆雷CK, et al。更新疟疾快速诊断测试。中国Microbiol启21:97 2008;110年。
Ishengoma DS,等。利用快速诊断测试的疟原虫的DNA来源分子分析疟疾发病率下降的时代。颧骨j . 2011; 6。
Makler MT和Hinrichs DJ。测量乳酸脱氢酶的活性恶性疟原虫作为一个评估的寄生虫血症。地中海是J太Hyg。1993; 48:205 - 210。
Makler MT, et al。疟原虫乳酸脱氢酶的测定恶性疟原虫药物敏感性。地中海是J太Hyg。1993; 48:739 - 741。
马赫SP, et al .高度敏感,pcr方法检测恶性疟原虫克隆在微量滴定板。颧骨j . 2008; 7:222。
载体W和詹森简森-巴顿。连续的恶性疟原虫文化:气候对疟疾的影响研究。Int J Parasitol。1997; 27:989 - 1006。
小林T, et al。疟疾诊断跨国际疟疾研究中心卓越:平台,性能,和标准化。地中海是J太Hyg。2015; 93:99 - 109。
贝尔D, et al。保证质量和访问疟疾诊断:如何能被实现吗?Nat Microbiol牧师。2006;4:682 - 695。
穆迪a为疟疾寄生虫快速诊断测试。ClinMicrobiol启15:66 2002;78年。
古蒂ID和Taraschi TF。恶性疟原虫:一个简单、快速的方法检测寄生虫在微量滴定板克隆。Exp Parasitol。1997; 86:158 - 160。
图雷FS, et al .红细胞绑定的恶性疟原虫抗原(eba - 175):改进的嵌套式聚合酶链反应的基因型的决心。太地中海Int健康。2001;6:767 - 769。
Snounou G,等。高灵敏度的检测人类疟疾寄生虫通过使用嵌套的聚合酶链反应。摩尔生物化学Parasitol。1993; 61:315 - 320。